全面解析 | 呼吸道病原体多重核酸检测标准物质和第三方质控品的研制,及其在临床检测实验室质量控制中的应用

发表时间:2021-06-01 16:16作者:BDS李尔华
(BDS全新推出——呼吸道病原体多重核酸检测质控品)

呼吸道感染人群普遍高发、传播速度快、影响范围广,给人类健康带来严重威胁,快速鉴别诊断出致病的病原体感染,对于减少抗生素滥用与耐药有着重要的临床意义。

近些年,随着分子诊断技术,特别是多重PCR技术和一体化检测(微流控)技术的使用,呼吸道多重病原体检测得到了快速发展。近几年国内外的多重呼吸道病原体核酸检测市场如雨后春笋,一片火爆。据IVD领域媒体发文称梅里埃仅呼吸道联检产品 BioFire Respiratory 2.1 Panel 在 2020 年累计销售额就超过10亿欧元。而中国呼吸道感染核酸检测市场容量也将突破1000亿。目前国内已有多厂家推出呼吸道多重病原体检测试剂盒产品,并在临床中广泛应用。

(国内部分厂家呼吸道多重病原体检测产品表)

千亿风口上,国家也出台系列监管措施,如国家药监局2019年发布《呼吸道病毒多重核酸检测试剂注册技术审查指导原则(2019年第80号)》,明确指出,呼吸道病毒多重核酸检测试剂应检测八种病毒:甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肠道病毒/鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和冠状病毒。


(截图来自NMPA)

国家卫健委近来发布一系列抗菌药物临床管理规范,并且将抗生素纳入公立医院考核,明确提出感染性疾病专业要提高呼吸道病原核酸检测率。近日,国家卫健委临检中心下发了全国传染病病毒核酸检测(呼吸道病毒)室间质量评价预研活动安排及注意事项,这也是首次进行呼吸道多重病原体检测室间质评预研活动!


据悉本次质评考核的项目为:新型冠状病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、副流感病毒和肠道病毒。本次呼吸道多重病原体检测纳入的9种病原体均为上呼吸道常见病原体,从目前已经获批的产品来看,基本覆盖了已经获批的呼吸道多重病原体检测产品能够覆盖的病原体。


当前,全国疫情防控进入常态化阶段,各地着力加强核酸检测能力建设,核酸检测量大幅度增长,效率明显提升。在保障核酸检测量增加的同时,加强质量控制,保证检测结果准确可靠,使核酸检测既保“量”又保“质”,为做好常态化疫情防控工作提供有力技术支撑。疫情以来,卫健委发布了系列加强实验室的质量管理的通知,特别强调了各医疗机构应当加强核酸检测质量控制:
  • 实验室要做好日常室内质控(IQC)
  • 实验室应对检测体系进行必要的性能验证(PT)
  • 应常态化接受国家级或省级检验室间质量控制(EQA)
呼吸道病毒多重核酸检测技术具有特异性好、灵敏度高,但是在临床检验的应用中还存在着一定的缺陷,特别是在质量控制方面存在着差异。特别是产品的溯源性不强不统一,不同地区医院、不同试剂、不同时期测量结果的无法达到一致性和可比性,各级医院检验结果的不通用不互认,极大的增加患者因为重复检测带来的身体伤害和经济负担,浪费资源等现象。而这一原因最主要的是核酸标准物质、质控品的缺乏和过度依赖国外产品,不能满足行业日益发展的要求。



核酸检测用标准物质与质控物现况



1.国际标准物质现况
目前核酸类WHO标准物质不多,研制单位主要为英国国家生物制品检定所(NIBSC),已有SARS-CoV-2 RNA、HAV RNA、HBV DNA、HCV RNA、HDV RNA、HEV RNA、HPV16 DNA、HPV18 DNA、HIV-1 RNA、EBV DNA、B19 VDNA和HCMV DNA等核酸检测用国际标准品。

2.国内有证标准物质现况
国内核酸检测用有证标准物质研制单位有卫生部临床检验中心、中国计量科学研究院、上海市计量测试技术研究院、上海市临检中心、广州邦德盛生物科技有限公司、北京康彻思坦生物技术有限公司等单位。另外,中国食品药品检定研究院针对核酸检测试剂盒研制了大量国家参考品。

广州邦德盛生物科技有限公司是国内最大的标准物质研制企业,已获批的有证国家二级标准物质有SARS-CoV-2 RNA、HBV DNA、HCV RNA、HPV16 DNA、HPV18 DNA、HIV-1 RNA、EBV DNA、HCMV DNA、PRRSV LV RNA、PRRSV JXA1 RNA、PRRSV VR2332 RNA、非洲猪瘟病毒B646L基因等。

3.呼吸道病原体多重核酸检测标准物质和第三方质控物现况


(1)国家参考品

中国食品药品检定研究院已有针对呼吸道病原体多重核酸检测的国家参考品。

(2)室间质量评物

国家卫健委临检中心下发了全国传染病病毒核酸检测(呼吸道病毒)室间质量评物,项目为:新型冠状病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、副流感病毒和肠道病毒。

(3)有证国家二级标准物质和第三方质控品

主要生产企业为广州邦德盛生物科技有限公司。
我国按照《计量法》和《标准物质管理办法》的规定,将标准物质作为计量器具施行法制管理。国家市场监督管理总局对标准物质的申报、技术审查、定级、批准发布都作出了明确的、严格的规定。经批准的标准物质定级证书。标准物质主要用途:
(1)量值传递;
(2)校准、测试仪器;
(3)性能评价和控制测试方法;
(4)室内质量控制;
(5)室间质量控制。



呼吸道病原体多重核酸检测用标准物质与第三方质控品的应用



(一)呼吸道病原体多重核酸检测用标准物质与第三方质控品的研制要求选择原则


1.主要生物原料选择要求

主要原料的选择要遵循适用性、代表性和易复制性原则。呼吸道病毒质控物的主要原料包括天然材料和人工合成材料。优先选择收集的天然材料(如灭活病毒培养液),对于难以在临床或大自然中收集到的、传染风险高的样本,推荐使用人工合成的原料。人工合成的材料包括重组腺病毒、重组慢病毒、装甲RNA、稳定转染细胞系等。在制备时,应符合如下三点要求:
  1. 建议保留核酸序列的完整性,不推荐使用某片段基因作为制备质控物的原料;
  2. 不推荐使用质粒作为原料;
  3. 需要进行灭活处理(化学灭活、物理灭活),尽可能确保生物安全性。



2.基质选择要求

只要足够稳定,首选液态基质,可减少复溶引入的不确定度。呼吸道病毒质控物的基质应和临床上取样检验的样本保持一致或尽可能接近。基于呼吸道病毒的传染性,选择基质应符合以下几个原则:
  1. 满足与临床样本间的互换性要求;
  2. 无明显基质效应;
  3. 基质中应包含一定灭活能力的成分。



3.通用性要求

质量控制时,首选有证国家标准物质和第三方质控品。质控物应适用于不同的检测平台、不同的检测方法学以及所有厂家的检测试剂盒。包括FQ-PCR、qPCR探针法、数字PCR法、恒温扩增技术、RNA捕获探针法、测序法等方法学。为独立、客观的第三方质控品,即不专为某特定方法或仪器设定或使其最佳化、其性能与试剂或试剂盒批号完全无关、可以对检测系统提供无偏倚评估的控制品。


4.质控品应参与核酸提取

可对实验操作的全过程进行质量控制。


5.量值具有溯源性

如采用数字PCR方法对目标基因拷贝数进行绝对定量。


6.质量稳定均匀性好


7.建议选多项病原体混合质控品

实验室进行内部质量控制时,应尽可能检测不同的病原体,防止出现漏检。


8.质控品浓度的选择

每次实验应当随机放入放入至少1份弱阳性(1.5-5倍检测限)和1份阴性质控品进行质量控制,及时发现问题,避免假阴性和假阳性。


9.试剂盒性能验证项目

主要对精密度、检测限、阳性符合率、特异性(阴性)符合率、抗干扰能力进行验证。



(二)标准物质及第三方质控品在临床检测实验室质量控制中的应用及示例

01.有证国家二级标准物质的应用

示例1:有证国家二级标准物质 【研制单位:广州邦德盛生物科技有限公司】
注:新型冠状病毒核酸标准物质可用于量值传递;校准、测试仪器;性能评价和控制测试方法;室内质量控制;室间质量控制。



02. 室内质控品(IQC)

示例2:呼吸道病原体多重核酸检测室内质控品(混合型) 【研制单位:广州邦德盛生物科技有限公司】


示例3:呼吸道病原体多重核酸检测室内质控品(组合型)研制单位:广州邦德盛生物科技有限公司】

注:第三方质控品,适用于不同的检测平台、不同的检测方法学以及所有厂家的检测试剂盒,包括FQ-PCR、RNA捕获探针法、测序法等方法学。



03. 室间质评物(EQA)

示例4:呼吸道病原体多重核酸检测室间质评物(0.5mL/管,5管/套)研制单位:广州邦德盛生物科技有限公司】
注:第三方质控品,适用于不同的检测平台、不同的检测方法学以及所有厂家的检测试剂盒,包括FQ-PCR、RNA捕获探针法、测序法等方法学。




04. 性能验证参考品(PT)

(1) 性能验证条件:
  • 年度性能验证:对所开展的检验项目的分析性能及/或方法学至少每年进行一次评价。
  • 新安装的仪器:新仪器拟开展的项目必须进行分析性能和/或方法学评价。
  • 仪器故障维修后或更换主要的配件后:可能会对结果产生影响时,必须要对其所开展的检验项目进行分析性能评价。
  • 仪器校准后:必须要对其所开展的检验项目进行分析性能及/或方法学评价。
  • 新开展的项目:必须进行分析性能及/或方法学评价。
  • 试剂变更厂家:进行分析性能及/或方法学评价。

(2) 评价要求:操作者应先熟悉仪器设备及操作过程。应对检验方法的熟练包括:标本、试剂的处理和贮存、正确的实验步骤、合理地解释结果及检测系统的质量控制。维持仪器的可靠和稳定。对仪器全面维护,必要时更换新的零部件。系统地检测仪器性能,确认达到要求。检测方法和/或仪器近期的室内质控和室间质评结果,确认达到要求。检测该仪器近期的校准记录,确认达到要求。

(3) 分析性能验证评价内容包括:精密度、检测限、阳性符合率、特异性(阴性)符合率、抗干扰能力。

示例5:呼吸道病原体多重核酸检测性能验证参考品 研制单位:广州邦德盛生物科技有限公司】
备注:可根据检测不同呼吸道病原体组合,提供个性化定制产品。
研制单位:广州邦德盛生物科技有限公司


性能验证参考品:呼吸道病原体多重核酸检测性能验证参考品

1.概述
本呼吸道病原体多重核酸检测性能验证参考品是以呼吸道相关病原体灭活培养物为原料,用核酸样本保存液稀释制备成所需系列性能验证参考品盘。此性能评价参考品均匀、稳定,与临床样本具有良好的互通性,采用数字PCR法或紫外分光光度法结合荧光定量PCR法。
用途:本性能参考品可用于进行呼吸道病原体多重核酸检测试剂生产厂家、进行呼吸道病原体多重核酸检测的相关实验室的相关性能评估。

2.参考品组分












性能验证报告示例



总之,引发呼吸道感染的病原类型多,症状表现相似,给临床医生的诊断带来很多困难,快速鉴别诊断出致病的病原体感染,对于减少抗生素滥用与耐药有着重要的临床意义。防控中核酸的精准检测尤其重要,检测中除了加强对试剂和仪器厂家的监管,保证产品质量外,强化实验室检测质量控制也必须和检测摆在同等重要的位置。质量控制离不开标准物质和质控品,高质量的呼吸道病原体核酸标准物质和第三方质控品的选择尤其重要。




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【原创】李尔华
【编辑】Hoyu
【审核】钟凤然
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