#CMDE丨国家药监局发布3项体外诊断试剂指导原则

发表时间:2021-01-20 17:13作者:BDS

为加强医疗器械产品注册工作的监督和指导,进一步提高注册审查质量,国家药品监督管理局组织制定了《肺炎支原体IgM/IgG抗体检测试剂注册技术审查指导原则》《隐球菌荚膜多糖抗原检测试剂注册技术审查指导原则》《遗传性耳聋相关基因突变检测试剂注册技术审查指导原则》,现予发布。

截图来源于CMDE

01

肺炎支原体IgM/IgG抗体检测试剂注册技术审查指导原则
肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,MP)属于柔膜体纲,支原体属,是引起儿童和成人呼吸道感染及社区获得性肺(community-acquired pneumonia,CAP)的常见病原体之一。MP感染广泛存在于世界各地,平时散在性发病,每隔数年会出现地区周期性流行,每次流行持续数月到数年不等。对于群聚性发病或初始经验性治疗无效的CAP患者,住院或重症CAP患者,建议进行致病原检查,明确CAP致病原可有助于进行针对性抗感染治疗。
肺炎支原体的检测对于支原体肺炎的诊断至关重要,实验室检测方法包括病原体培养、抗原检测、抗体检测和核酸检测。肺炎支原体培养难度较大,需采用专门的培养基和培养技术,耗时长,但特异性高。血清特异性抗体检测是目前辅助诊断肺炎支原体肺炎的重要手段,免疫层析法、酶联免疫法和化学发光法抗体检测试剂在临床中广泛应用。颗粒凝集(particleagglutination,PA)试验和补体结合(complement fixation,CF)试验是检测肺炎支原体抗体的传统方法,但是无法区分IgM和IgG。

本指导原则适用于采用免疫层析法、酶联免疫法或化学发光法,体外定性检测人血清、血浆或全血中的肺炎支原体IgM和/或IgG抗体的试剂。结合临床和其他实验室指标,可用于肺炎支原体感染的辅助诊断。对基于其他方法学的试剂,及肺炎支原体其他抗体或总抗体检测试剂,可能部分要求不完全适用或本文所述内容不够全面,申请人可以参照本指导原则,根据产品特性对适用部分进行评价或补充其他的评价资料进行相应验证。


02

隐球菌荚膜多糖抗原检测试剂注册技术审查指导原则

隐球菌病是一种由隐球菌感染引起的深部真菌病,可累及全身多个系统。隐球菌属内对人致病的最主要病原菌是新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)和格特隐球菌(Cryptococcus gattii)。根据新生隐球菌荚膜多糖成分和生化方面的差异,将新生隐球菌分成2个变种(新生隐球菌新生变种C.neoformans var.neoformans和新生隐球菌格鲁比变种C.neoformans var.grubii),按血清学分为A、B、C、D和AD型5个型。其中新生变种为血清D、AD型,欧洲、南美洲流行;格鲁比变种为血清A型,全球流行;格特隐球菌为血清B、C型,在热带\亚热带\温带流行;我国血清型主要为A型。此外,还发现了新生变种与格鲁比变种的杂合体(血清型AD)。隐球菌的基因型包括新生隐球菌的VNⅠ、Ⅱ、Ⅳ、B和格特隐球菌的VGI-VGIV。两种隐球菌的无性繁殖体均为无菌丝的单芽孢酵母菌,在体外为无荚膜或仅有小荚膜,进入人体内后很快形成厚荚膜,有荚膜的隐球菌菌体直径明显增加,致病力明显增强。隐球菌荚膜的主要成分荚膜多糖是确定血清型特异性的抗原基础,并与其毒力、致病性及免疫性密切相关。隐球菌是一种机会感染性真菌,既可侵犯免疫力低下及免疫缺陷人群,也可发生于免疫正常者,可以感染人体的任何组织和脏器,最常见的部位是中枢神经系统,其次是肺部和皮肤。

中枢神经系统隐球菌感染通常表现为脑膜炎或脑膜脑炎,极少数表现为单个或多个局灶性肿块损害(隐球菌肉芽肿),中枢神经系统感染可伴发肺部或其他播散性感染,但大多数不伴有其他感染的临床表现。隐球菌感染中枢神经系统外的器官和部位,肺和皮肤是常见的两个部位。肺是隐球菌感染的主要门户,肺隐球菌感染的临床表现多种多样,可从无症状的结节到严重的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。皮肤隐球菌感染根据感染来源,可以分为原发性和继发性感染两种。继发性隐球菌感染一般预示已经发生播散性隐球菌感染,主要来源于血行播散,提示感染严重。

隐球菌感染的病原学及实验室检测包括隐球菌的微生物学鉴定,隐球菌病的免疫学诊断(血清学实验),隐球菌的药物敏感试验和隐球菌病的组织病理学。其中隐球菌病的免疫学诊断(血清学实验)临床上常用的为隐球菌荚膜多糖抗原检测,其方法有乳胶凝集试验(Latex Agglutination test ,LA)、酶联免疫分析法(Enzyme Immunoassay ,EIA)及侧向免疫层析法(Lateral Flow Immunoassay ,LFA)等。隐球菌荚膜多糖抗原检测可辅助诊断隐球菌感染,隐球菌荚膜多糖抗原阳性提示隐球菌感染,脑脊液中隐球菌荚膜多糖抗原滴度的高低可提示疾病的严重程度。隐球菌荚膜多糖抗原检测因其简单、快速已经是目前国内临床辅助诊断隐球菌感染最常用的方法之一。

本指导原则适用于利用酶联免疫法、乳胶凝集试验和侧向免疫层析法等基于抗原抗体反应原理,对来源于血清和/或血浆和/或全血和/或脑脊液等人体样本中的隐球菌荚膜多糖抗原进行体外定性检测的试剂。结合临床和其他实验室指标,可用于隐球菌感染的辅助诊断。如涉及半定量检测试剂,或待测样本类型为血清、血浆、全血、脑脊液外其他样本类型(如尿液、肺泡灌洗液),应对半定量或其他样本类型的性能进行研究,并根据申请的预期用途设计临床试验进行验证。可适量参考本指导原则相关要求。

本指导原则仅包括对隐球菌荚膜多糖抗原检测试剂申报资料中部分项目的要求,适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品。其他未尽事宜,应当符合《体外诊断试剂注册管理办法》(原国家食品药品监督管理总局令第5号)(以下简称《办法》)、《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》(原国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号)等相关法规和文件的要求。

03

遗传性耳聋相关基因突变检测试剂注册技术审查指导原则

耳聋是一种常见的感觉障碍性疾病,耳聋病因复杂,目前研究认为约60%重度耳聋的发病与遗传有关。遗传性耳聋主要涉及四种遗传方式:常染色体隐性、常染色体显性、线粒体遗传、性染色体连锁遗传。按耳聋和言语功能发育的关系可分为语前聋和语后聋。言语功能发育之前发生的重度或极重度耳聋称为语前聋,在言语功能发育完成后开始的耳聋称为语后聋。一般来说,常染色体隐性遗传性耳聋表现为先天性聋或语前聋,常染色体显性遗传耳聋多表现为语后聋或渐进性听力下降。药物性耳聋、大前庭水管综合征等遗传性耳聋也可表现为后天迟发性。遗传性耳聋根据是否伴有多个系统病变分为综合征型耳聋与非综合征型耳聋,综合征型耳聋一般除了听力损伤外还伴有其他器官系统异常,表现为多种表型,与非综合征型耳聋相比其遗传背景更为复杂。目前遗传性耳聋中约有30%为综合征型耳聋,70%为非综合征型耳聋。其中,非综合征型常染色体隐性耳聋最常见,约占80%。

耳聋具有显著的遗传异质性,不同的种族中常见的致聋基因不同,进化过程造成了人种间遗传差异、人群迁徙和血源融合又导致了局部地区人群遗传背景的复杂化,中国耳聋人群中基因突变热点、突变谱、表型与基因型对应性与其他人种耳聋人群存在一定差异。在我国,约70%的遗传性耳聋变异来自于GJB2、SLC26A4、GJB3及线粒体DNA 12SrRNA 等4个常见致聋基因。目前常规建议进行的检测位点主要涉及4个基因的9个突变位点,具体为GJB2基因:c.35delG、c.235delC、c.176-191dell6和c.299-300delAT;SLC26A4基因:c.2168A>G和c.919-2A>G(IVS7-2A>G);GJB3基因:c.538C>T;12SrRNA基因:m.1494C>T和m.1555A>G。各位点相关情况如下:GJB2基因:GJB2基因位于人类染色体13q11-12,其基因短小,包含2个外显子,编码226个氨基酸,编码缝隙连接蛋白26,耳蜗缝隙连接蛋白的作用是维持内耳钾离子平衡,同时在内耳的生理功能中发挥非常复杂的作用,包括参与第二信使的转运及耳蜗内电位的产生。目前已发现的GJB2基因致聋突变超过200个,是迄今为止在多个人种中最常见的致聋基因,国外研究认为常染色体隐性遗传性耳聋患者中,约有50%由GJB2基因突变引起。但是该基因致聋比例在不同人种中存在差异。其主要突变方式为缺失,其中,c.235delC是中国人群中发生频率最高的突变,其他位点还包括c.299-300delAT、c.176-191del16、c.35delG等。

SLC26A4基因:又称PDS基因,位于人类染色体7q31,含有21个外显子,编码离子转运相关蛋白,在机体离子成分平衡的维持中发挥重要作用。该基因突变是导致前庭水管扩大(EVA)的责任基因,EVA是与儿童感音神经性聋相关的最常见的内耳畸形,大部分EVA患者变现为非综合征型耳聋(DFNB4),少部分同时合并甲状腺肿大,称Pendred综合征。对于该类患者往往变现为迟发性、渐进性,头部碰撞、感冒等会引起颅内压变化的活动都可能会引起听力下降。在我国,约96%的前庭水管扩大患者由SLC26A4基因突变导致,中国耳聋人群中该基因突变检出率为20.35%,目前发现的该基因致病突变众多,突变位点及突变频率存在地域和种族差异,在中国c.919-2A>G、c.2168A>G为携带频率最高的SLC26A4基因热点突变,其次还有c.1229C>T、c.1975G>C、c.1174A>T等。突变等位基因按外显子排名由高到低为:外显子7+8、外显子10、外显子19、外显子17、外显子15。发生在上述外显子上突变约占90.61%。

GJB3基因:位于染色体1p35-p33,编码缝隙连接蛋白31,是国内发现、克隆并鉴定的第一个耳聋相关基因,可以引起常染色体显性或者隐性遗传。主要突变形式有c.538C>T的无义突变和c.547G>A的错义突变,其可能与语后高频听力下降相关,目前国外对GJB3基因突变引起耳聋的报道较少。

线粒体DNA(mtDNA)突变:mtDNA是存在于细胞质中、独立于核染色体的基因组,由于受精卵所含有的mtDNA来自于卵子的细胞质,因此主要为母系遗传。在细胞复制过程中mtDNA突变随机分配,母亲-子代突变比例可能差异较大,mtDNA存在状态阈值,即只有突变型DNA达到一定负荷率或mtDNA功能缺陷到一定程度才会产生相应表型。由mtDNA突变而引起的耳聋包括综合征型耳聋和非综合征型耳聋,其中mtDNA12SrRNA上的m.1555A>G、m.1494C>T突变是氨基糖苷类药物致聋的易感位点,突变携带者对氨基糖甙类药物异常敏感,低剂量使用该类药物就可能会出现耳鸣,甚至严重的听力下降。此外,其他mtDNA突变还可能引起综合征型耳聋,例如母系遗传糖尿病伴耳聋等。

除上述列举的代表性基因突变外,至今已有众多其他耳聋相关的致病基因被克隆或鉴定,但还有很多耳聋表型的致病基因不清楚。随着科学发展,可能发现其他意义明确的耳聋表型相关基因和突变位点并应用于临床。

目前,遗传性耳聋基因突变检测在遗传性耳聋的辅助诊断以及新生儿遗传性耳聋基因突变筛查等领域有重要意义。例如通过对具有耳聋症状和/或体征人群,以及其他需要进行耳聋基因突变检测的人群,如有耳聋家族史的人群等进行耳聋基因突变的检测可用于遗传性耳聋的辅助诊断;对新生儿进行遗传性耳聋基因突变筛查,可作为常规物理听力筛查的补充,特别是可发现常规物理听力筛查无法检出的药物性致聋基因携带者和迟发性耳聋基因携带者,从而进行早期干预和指导等。

遗传性耳聋的诊断是一项复杂的工作,诊断流程包含常规诊断的病史采集、体格检查、辅助检查、对先证者及家系成员进行家系分析和遗传性检测等。

结合该类产品临床使用的实际情况,本指导原则的预期用途可为:用于体外定性检测人外周静脉血或干血斑样本中人基因组DNA的遗传性耳聋基因突变,用于遗传性耳聋的辅助诊断,或新生儿遗传性耳聋相关基因突变的筛查,具体预期用途应与产品临床验证相对应。

耳聋基因突变检测方法众多,国内应用较多的有高通量测序、飞行时间质谱、限制性酶内切法、荧光PCR法、微阵列芯片技术、PCR+导流杂交法等,其具体的检测原理存在差异,目前以仅包含PCR扩增反应或后续结合探针杂交反应进行位点检测的试剂盒较为常见,因此,本指导原则的技术要求适用于主要基于PCR扩增类(如荧光PCR法、微阵列芯片技术、PCR+导流杂交法)的检测试剂,对于其他检测技术(如PCR-质谱、高通量测序),申请人可以根据产品特性对不适用部分进行或补充其他的评价和验证,但需阐述不适用的理由,并验证替代方法的科学合理性。

本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。

图文编辑:Hoyu
审核:Chill Tan

点击阅读原文可下载指导原则全文


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